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PCR儀的種類及選購(gòu)
2012-06-19
PCR的原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的作用下，以單鏈為模版，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成新的單鏈，與模版配對(duì)成為雙鏈分子挎貝。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)與模板DNA的5’端結(jié)合的兩條引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制，多次重復(fù)“變性解鏈—退火—合成延伸”的循環(huán)就可以以幾何級(jí)數(shù)大量擴(kuò)增特定的基因。
從PCR原理可以看出，PCR儀的關(guān)鍵是升降溫的步驟。現(xiàn)在偶爾還能聽到一些前輩們笑談早年的PCR實(shí)驗(yàn)如何在3個(gè)中完成的趣聞。經(jīng)過不斷改進(jìn)，今天的PCR已經(jīng)越來越完善和智能化。出于市場(chǎng)推廣的戰(zhàn)略需要，各廠家的PCR儀型號(hào)不同，著力宣傳的技術(shù)指標(biāo)和參數(shù)也不盡統(tǒng)一，天呈在這里簡(jiǎn)單列出選購(gòu)時(shí)我們認(rèn)為應(yīng)該考慮的常用指標(biāo)，希望有助于大家選購(gòu)PCR儀的選購(gòu)技巧。
PCR儀的種類：
PCR儀的種類總體來說可以分為兩大類：PCR擴(kuò)增儀和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，普通的PCR擴(kuò)增儀又衍生出帶梯度PCR功能的梯度PCR儀、和帶原位擴(kuò)增功能的原位PCR儀等等。
PCR最重要的就是個(gè)升降溫過程，最初的水浴鍋式PCR，就是三個(gè)水浴箱，一個(gè)機(jī)械臂，定時(shí)抓出反應(yīng)槽轉(zhuǎn)換水浴鍋。這種儀器體積大，迅速慢，但其實(shí)結(jié)果并不比以后的PCR儀差。后來有人利用致冷和加熱做成了，固定位置升降溫的PCR擴(kuò)增儀。
后來隨著定量技術(shù)的發(fā)展，有公司將擴(kuò)增儀和檢測(cè)做成一體，也就成了現(xiàn)在的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。1996年由ABI公司首先推出將擴(kuò)增和檢測(cè)融為一體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
PCR儀的選購(gòu)：
一、溫度控制
對(duì)普通PCR儀來說，溫度控制主要是介質(zhì)問題，理想的介質(zhì)是導(dǎo)熱性好、比熱大、接觸緊密的物質(zhì)。溫控指標(biāo)主要是指溫度的準(zhǔn)確性、均勻性、以及升降溫速度，對(duì)梯度PCR儀來說，除了溫度的準(zhǔn)確性和均勻性、升降溫速度以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。關(guān)于溫度控制方面，作者將在以后的技術(shù)文章里詳細(xì)介紹。
二、儀器的功能性和人性化設(shè)計(jì)
當(dāng)然是越簡(jiǎn)單方便的設(shè)計(jì)最符合用戶的要求。
熱蓋——現(xiàn)在的PCR儀一般均配備熱蓋，熱蓋溫度設(shè)為105℃，使樣品管頂部的溫度達(dá)到105℃左右，蒸發(fā)的反應(yīng)液就不會(huì)產(chǎn)生凝集在管蓋上而改變反應(yīng)體積，這樣用戶就無需再向反應(yīng)管內(nèi)加石蠟油，直接減少后繼反應(yīng)的麻煩。如果是旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋就要特別小心，因?yàn)閴毫Φ竭_(dá)時(shí)沒有明顯的提示，用戶需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將熱蓋旋到合適位置，不太容易掌握。如果過松，熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；如果過緊，則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的機(jī)械故障。最新的ESP技術(shù)是指熱蓋加熱時(shí)不接觸樣品管，避免加熱樣品管導(dǎo)致非特異產(chǎn)物，等加熱到設(shè)定溫度后熱蓋下降，將樣品管壓入加熱模塊，下降時(shí)間和壓力都由電子控制。
樣品基座——PCR反應(yīng)多在0.2或者0.5的管子中進(jìn)行，多數(shù)PCR儀也配備了不同的可更換樣品槽適配不同的樣品管。eppendorf有一個(gè)有趣的設(shè)計(jì)，一個(gè)槽內(nèi)帶有0.2和0.5兩種不同樣品孔，不需更換基座就可以分別使用兩種不同的反應(yīng)管，或者96孔板，加原位適配器就可以變成原位PCR了。避免了換基座的麻煩。當(dāng)然不同的反應(yīng)管不可以同時(shí)使用的，因?yàn)楦叨炔煌瑹嵘w不能作用。ABI的9700就可以更換不同的樣品槽，樣品槽系列擴(kuò)增到從0.5到標(biāo)準(zhǔn)96孔，到雙384孔板，分別適合不同的需要，相當(dāng)靈活。
軟件——新的PCR儀都比較注重程序編寫的簡(jiǎn)易性。大屏幕，顯示實(shí)時(shí)信息，倒計(jì)時(shí)，記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)斷電保護(hù)等都有助于實(shí)驗(yàn)室中的復(fù)雜環(huán)境使用。程序儲(chǔ)存方面，有人覺得儲(chǔ)存程序的多少似乎意義不太大，但是對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員多、PCR儀每天運(yùn)作頻繁的實(shí)驗(yàn)室來說，每個(gè)使用者獨(dú)立儲(chǔ)存自定義的PCR程序，確實(shí)能方便下一次的調(diào)用，會(huì)節(jié)約一些時(shí)間。
綜合考慮，一臺(tái)PCR儀選購(gòu)的關(guān)鍵還是在于用戶自己的要求，有些功能可能都用不上或很少用，用戶需要仔細(xì)斟酌，畢竟是一分錢一分貨。
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