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氨基酸總量的檢測
2011-04-15
蛋白質(zhì)經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨，肽等最后成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。
水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評價食品的營養(yǎng)價值。
氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸態(tài)氮)的百分率表示，當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。
食品在評價蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值時，除了測定pro的含量，氨基酸氮含量，還需要對各種氨基酸進(jìn)行分離，鑒定，尤其對8種人體必需氨基酸進(jìn)行定量定性分析。
一.單指示劑甲醛滴定法：
1原理：氨基酸具有酸，堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷?COOH基，而-COOH基顯示酸性，又含有-NH2，-NH2則顯示堿性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛溶液時，-NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就可用堿來滴定-COOH基，以間接方法測定氨基酸的量，反應(yīng)式以三種形式存在。
用堿完全中和-COOH基時的PH值為8.4~9.2。
2試劑：
(1)40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，將甲醛用1N NaOH溶液中和(淡蘭色)。(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。
(3)0.100N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3操作步驟：
稱約含20mg左右的氨基酸→于燒杯中(如為固體樣加水50ml)→加兩滴指示劑→用0.1NNaOH溶液滴定到淡蘭色→加中性甲醛20ml→搖勻→靜置1分鐘→此時蘭色應(yīng)消失→再用0.1NNaOH溶液滴定淡蘭色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)。
計算：氨基酸態(tài)氮=(N×V×0.014×100)/W×100
二.雙指示劑甲醛滴定法
1原理：
與單色法相同，只是在此法中使用了兩種指示劑，從分析結(jié)果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮?dú)馊萘糠?此法操作復(fù)雜，但準(zhǔn)確，不作介紹)相近，單色滴定法稍偏低，主要因?yàn)閱沃甘緞┘兹┑味ǚㄊ且园被崛芤旱腜H值作為中性紅的終點(diǎn)，PH值為7.0，從理論計算看，雙色滴定法比單色滴定法準(zhǔn)確。
2試劑：同單指示劑一樣，多一個0.1%中性紅(50%乙醇溶液)
3操作步驟：
取相同兩份樣品→分別于100ml三角瓶→一份加中性紅2滴→用0.1N NaOH滴定終點(diǎn)(由紅變琥珀色)，記錄用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml→搖勻→用0.1N NaOH滴至淡蘭色。
計算：
氨基酸態(tài)氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100
V1——用中性紅為指示劑時，堿液所消耗的體積
V2——用百里酚酞乙醇液為指示劑時標(biāo)液消耗量
0.014——氮的毫克當(dāng)量濃度
氨基酸總量的檢測
注意事項(xiàng)：
(1)單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時的pH為8.5—9.5
(2)測定樣品的顏色較深，應(yīng)加活性炭脫色之后再滴定
三.茚三酮比色法：
1原理：氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成蘭紫色化合物。可以用比色法定量測定。
2試劑：
(1)磷酸緩沖液(pH.8.04)制備方法如下：
稱磷酸二氫鉀4.5350g。定容500ml
稱NAH2PO4·12H2O 11.9380g分別溶解定容500ml
取磷酸二氫鉀10ml與磷酸氫二鈉190ml混合即為pH8.04的緩沖液
(2)2%茚三酮溶液：
稱茚三酮1g→溶于35ml熱水→加入40mg氯化亞錫(SnCl2·H2O)攪拌過濾(作防腐劑)→于冷暗處過夜→定容50ml
① 氨基酸標(biāo)液
稱干燥氨基酸(如異亮氨酸)0.2000g→溶解定容100ml→搖勻→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml標(biāo)液
3操作方法：
(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
取7個25ml容量瓶，吸取標(biāo)液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7個25ml容量瓶，加水補(bǔ)充至容積為4ml，然后加茚三酮和緩沖液各1ml，于水浴加熱15分鐘，冷卻后定容25ml，靜置15分鐘，在570nm下測消光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)樣品測定：
取樣品5.00~10.0g(液體樣5-10ml)→于燒杯中→加50ml水和活性碳約5g→加熱過濾→用30—40ml熱水洗滌活性炭→吸澄清樣液1~4ml→加茚三酮和緩沖液各1ml水浴加熱15分鐘，冷卻定容，靜置15分鐘于570nm下測定消光值，按下式計算氨基酸含量。
氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100
C——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得得氨基酸的量(Ug)
W——測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量(g)
注意事項(xiàng)：
茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：、
取10g茚三酮容于40ml熱水中，加一克活性炭，搖勻靜置30分鐘，過濾，將濾液放入冰箱中過濾，即出現(xiàn)蘭色結(jié)晶，過濾，用2ml冷水洗滌結(jié)晶，置干燥皿中干燥，裝瓶備用
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